Vegetal, Edificio I + D + I, Plaza del Hospital s / n, Политехнический университет Картахены, 30202 Картахена, Испания

Маркос Эгеа-Кортинес

¹ Genética Molecular, Instituto de Biotecnología Vegetal, Edificio I + D , Plaza del Hospital s / n, Политехнический университет Картахены, 30202 Картахена, Испания

¹ Genética Molecular, Instituto de Biotecnología Vegetal, Edificio I + D + I, Plaza del Hospital s / n, Политехнический университет Картахены, 30202 Картахена, Испания

² Биомедицинская информационная и биоинформатическая платформа, Биомедицинский научно-исследовательский институт Мурсии, Университетская клиническая больница «Вирхен-де-ла-Арриксака», Университет Мерсии , 30120 Мерсия, Испания

³ Escuela Técnica Superior de Ingeniería de Telecomunicación (DSIE), Campus Muralla del Mar, s / n, Universidad Politécnica de Cartagena, 30202 Cartagena, Spain

Получено 17 июля 2019 г . ; Принята в печать 16 августа 2019 г.

Abstract

Циркадные часы растений контролируют большое количество внутренних процессов, включая рост и обмен веществ. У многих видов, таких как львиный зев, испускание запаха имеет циркадный характер. Здесь мы показываем, что устранение LATE ELONGATED HYPOCOTYL в Antirrhinum majus влияет на рост и испускание запаха.Чтобы понять кинетику роста, мы применили феноменальный подход с использованием собственных систем искусственного зрения и получения покадровой видеозаписи. Цветы дикого типа показали более высокую скорость роста, чем растения нокдаун. Максимальная скорость роста была снижена на 22% у растений с более низкой экспрессией LHY . Летучие вещества растений были по-разному затронуты, поскольку растения с РНКи показали повышенную эмиссию соединений, синтезированных из коричной кислоты, и замедленную эмиссию метаболитов бензойной кислоты. Монотерпены мирцена и оцимена были отложены, тогда как сесквитерпен фарнезен был продвинут. В целом трансгенные линии показали измененный образец испускания летучих и измененный профиль запаха. Наши результаты показывают, что AmLHY играет важную роль в количественном и качественном контроле роста цветков и испускания запаха.

Ключевые слова: antirrhinum, аромат, искусственное зрение, биологический ритм, развитие цветов, скорость роста, феномены, РНК-интерференция, летучие органические соединения

1.Введение

Цветочные органы расположены в виде мутовок чашелистиков, лепестков, тычинок и плодолистиков. Они обретают свою идентичность, когда активируется набор генов, называемых генами идентичности цветочных органов. Эти гены идентичности органов активируют морфогенетическую программу в комбинациях [1]. Гены MADS-BOX DEFICIENS и GLOBOSA образуют белковые комплексы, которые управляют развитием лепестков и тычинок [2,3]. Так называемые гены C-функции участвуют в идентификации органов тычинок и плодолистиков [4] и вызывают прекращение развития меристемы цветков [5,6].

Размер цветочного органа в первую очередь количественно контролируется генами идентичности органа [7,8]. Изменения размера органов цветка происходят за счет изменений времени и / или скорости деления и размножения клеток [9,10]. Боковые органы растут за счет деления и расширения клеток. Несколько генов, контролирующих эти процессы, также играют роль в окончательном размере цветка. Среди них — фактор транскрипции AINTEGUMENTA [1,2,3,4], влияющий как на деление, так и на рост клеток, и фактор EXPANSINS , который в первую очередь контролирует рост клеток [11,12].

Излучение цветочного аромата во многих случаях происходит из тканей лепестков [13] и имеет несколько функций, включая привлечение и направление опылителей и отталкивание вредных насекомых [14,15]. Помимо важной роли выбросов летучих органических соединений (ЛОС) в воспроизводстве и защите растений, общий цветочный букет, воспринимаемый обонятельной системой человека, также имеет эстетическую ценность [16,17]. Цветочные летучие вещества выделяются циркадным образом, и этот факт характеризует некоторые растения как дневные источники излучения, такие как Antirrhinum или розы, или ночные излучающие вещества, такие как Petunia или Silene [18,19,20], что указывает на то, что большинство летучие компоненты выпускаются в течение определенного периода времени.

Циркадные часы широко изучались у Arabidopsis [21]. Исследования циркадных часов у других видов во все большей степени способствуют пониманию генетики циркадных часов у растений и важности их реструктуризации для оптимальной адаптации к окружающей среде [22,23,24]. Расширение клеток контролируется циркадными часами через координацию белков DELLA (аспарагиновая кислота-глутаминовая кислота-лейцин-лейцин-аланин) и факторов транскрипции ФАКТОРА ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ФИТОХРОМА (PIF) [25].Деление клеток также находится под прямым контролем часов посредством связывания TIMING OF CAB 1 с промотором CDC6 у Arabidopsis [26]. Распространение запаха также напрямую контролируется часами. Нокаут LATE ELONGATED HYPOCOTYL ( LHY ) в Petunia вызывает понижающую регуляцию пути бензоид / фенилпропаноид [27], ограничивая время выделения летучих веществ из цветов до вечера. Дополнительное доказательство прямой роли циркадных часов в регуляции испускания цветочного запаха было обнаружено в Nicotiana attuate , где нокдаун LHY или ZEITLUPE вызывает изменения в эмиссии аттрактанта бензилацетона [28].Недавняя работа показала, что ортолог ZEITLUPE в Petunia , PhCHANEL координирует профили запахов [29].

В этой работе мы рассмотрели функцию гена основных часов LHY на развитие цветков в Antirrhinum majus с использованием РНК-интерференции. Используя феноменальный подход, мы проанализировали влияние сбивания AmLHY на рост. Мы также подробно проанализировали функцию AmLHY на испускание запаха. Наши результаты указывают на нелинейный и сложный контроль процесса синтеза и испускания цветочного аромата с помощью AmLHY .

2. Материалы и методы

2.1. Филогенетический анализ

Мы получили ген AmLHY с помощью BLAST (Basic Local Aligment Search Tool) против набора геномных каркасов с использованием Arabidopsis LHY в качестве запроса. Мы использовали ген близкого родственника из Mimulus gutattus (Migut.N01518.2.p), загруженный из Phytozome, для получения модели кДНК с использованием Genewise [30].Регистрационный номер EMBL-EBI был PRJEB24602.

белковых последовательностей LHY / CCA1 были получены от National for Biotechnology Information (NCBI) с использованием BLASTp (таблица S1). Последовательности белков арабидопсиса REVEILLE (RVE) были использованы в качестве запроса для идентификации этих белков в Antirrhinum majus с помощью программы tblastn и версии 3 генома в базе данных генома Snapdragon (http://bioinfo. sibs.ac.cn/Am /index.php), недавно выпущенный [31]. Выравнивание белков выполняли с помощью CLUSTAL X, интерфейса Windows для программного обеспечения множественного выравнивания последовательностей ClustalW [32].Филогенетические деревья были построены с использованием библиотек R «ape» и «phangorn» [33,34], Максимальное правдоподобие использовалось в качестве статистического метода, а Jones, Taylor and Thornton (JTT) — в качестве модели замены аминокислот [35] с 1000 реплик начальной загрузки. Деревья визуализировались с помощью пакета R «ggtree» [36]. Белковые домены и функциональные сайты были выведены с помощью веб-инструмента PROSITE (https://prosite.expasy.org/) [37], а схематическая структура белков была построена с помощью пакета Bioconductor «drawProteins» [38].Все библиотеки были собраны под R версии 3.5.1.

2.2. Растительный материал и трансформация

Мы использовали плазмиду pHELLSGATE12 [39] для получения конструкции, включающей 156 п.н., начиная с 45 п.н. до предсказанного ATG. Antirrhinum majus гипокотилей линии Sippe 50 (Max-Planck-Institut für Pflanzenzüchtungsforschung, Кельн, Германия) трансформировали с использованием штамма Agrobacterium tumefaciens EHA105, как описано ранее [8]. Sippe 50 была инбредной линией, которая использовалась для генетического анализа с 1910 года [40,41].Поскольку с тех пор он подвергся самоопылению, он может считаться полностью гомозиготным. Трансгенные растения были подтверждены с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) на основе амплификации гена NPTII . Геномную ДНК выделяли из листьев с помощью набора (NucleoSpin ^® Plant II, Düren, Германия). ПЦР проводили с ДНК-полимеразой OneTaq ^® (подробности праймеров см. В Таблице S3). Условия ПЦР составляли 30 секунд при 94 ° C, затем 40 циклов по 15 секунд при 94 ° C, 30 секунд при 60 ° C и 30 секунд при 72 ° C и заканчивались через 5 минут при 72 ° C.

A. majus Sippe 50 и трансгенные семена львиного зева проращивали в вермикулите и помещали в камеру для выращивания с условиями цикла 16 часов света / 8 часов темноты при 23/18 ° C в течение дня и ночи, соответственно. Трансгенные растения детектировали с помощью ПЦР (NEB, One Taq DNA Polymerase, Ипсвич, Массачусетс, США) с использованием праймеров NPTII (Таблица S3). Мы выбрали 3 независимые линии: РНКи: AmLHY14, РНКи: AmLHY26 и РНКи: AmLHY27 . Позже сеянцы переносили в горшки со смесью торфа, вермикулита и перлита 1.1: 1 в теплице в естественных условиях. Наконец, за семь дней до отбора образцов, растения помещали в камеру для выращивания с циклами 12 часов света / 12 часов темноты с температурными циклами 23/18 ° C. Время Zeitgeber 0 (ZT 0) определялось временем включения света.

2.3. Анализ экспрессии генов

Полностью выросшие листья собирали с 3–4 растений с 6-часовыми интервалами в течение полного дня (24 часа). Листья немедленно замораживали в жидком N₂ и хранили при -80 ° C до использования. Тотальную РНК из листьев экстрагировали фенольным методом, как описано в ссылке [42], и обрабатывали ДНКазой I (Fermentas-ThermoFisher, Waltham, MA, USA). Равные количества тотальной РНК (ThermoFisher, NanoDrop 2000, Waltham, MA, USA) использовали для синтеза кДНК (ThermoFisher, Maxima First Strand cDNA Synthesis Kit, Waltham, MA, USA). Уровни экспрессии AmLHY анализировали с помощью количественной полимеразной цепной реакции (кПЦР) (система Agilent Mx3000P QPCR, Санта-Клара, Калифорния, США) с SYBR Green (TaKaRa, SYBR Green Master Mix, Кусацу, Сига, Япония) в соответствии с руководствами производителя. и следующий протокол был использован для 40 циклов: 95 ° C в течение 4 минут, а затем цикл при 95 ° C в течение 15 секунд, 60 ° C в течение 15 секунд и 72 ° C в течение 30 секунд. UBIQUITIN ( AmUBQ ) использовали в качестве внутреннего контроля, и образцы были проанализированы в двух экземплярах (таблица S3). Нормализованная экспрессия была выражена как 2 ^-ΔΔCt , поэтому мы использовали эффективность 2 для анализа данных [43]. Суточная экспрессия гена AmLHY была нормализована по среднему уровню экспрессии во времени; Экспрессия AmLHY в линиях РНКи была нормализована к WT. Чтобы проверить различия в экспрессии между растениями дикого типа и трансгенными растениями, мы выполнили тест Стьюдента t с использованием пакета stats в R (R версия 3.5.1).

2.4. Измерения цветов

Цветки A. majus Sippe 50 нетрансгенных братьев и сестер и поколения T2 измеряли через 2-3 дня после цветения в соответствии со ссылкой [44]. Цветки отбирали от 3 до 4 разных растений на группу. Всего мы измерили 8 цветков от нетрансгенных братьев и сестер, 9 цветков от RNAi: AmLHY14 , 4 цветков от RNAi: AmLHY26 и 7 цветков от RNAi: AmLHY27 линии. Цветочные параметры сравнивали у нетрансгенных и трансгенных братьев и сестер с помощью теста Стьюдента t , выполненного в R (R версия 3.5.1).

2.5. Анализ роста и искусственное зрение

Мы использовали систему получения изображений, описанную ранее [45,46]. Растения выращивали в камере для выращивания со светодиодным дневным светом, охватывающим от ультрафиолета до красного света. Ночные изображения получали путем активации инфракрасного света с длиной волны 840 нм в течение коротких интервалов времени (3 с). Изображения были получены с помощью камеры искусственного зрения, содержащей два датчика CCD, многоканальный 24-битный RGB, поглощающий на 610 нм, 540 нм и 460 нм, и монохроматический датчик, захватывающий на 800 нм.Полученные изображения имеют разрешение 1296 × 966 пикселей.

Мы получили данные с использованием периода свет / темнота 12 часов / 12 часов для A. majus Sippe 50 и сегрегационных братьев и сестер RNAi: AmLHY за период 8 дней и 7 часов. Изображения получали каждые 10 минут, всего 1196 изображений, включающих 3 цветка дикого типа и 3 трансгенных цветка. Используя полуавтоматический метод, мы измеряли длину каждые два часа. Кривая была подогнана к необработанным данным с использованием ОБЩЕЙ ДОБАВИТЕЛЬНОЙ МОДЕЛИ (GAM) с использованием пакета «mgcv» от R.Максимальный рост соответствовал максимальному размеру цветков, соответствующему максимальному значению кривой. Мы получили максимальный наклон, который соответствовал бы максимальной скорости роста, путем вычисления 200 точек кривой и получения наибольшего числа. Площадь под кривой была получена путем интегрирования подобранной кривой с использованием интегративной функции из пакета «stats».

2.6. Сбор летучих, газовая хроматография, масс-спектрометрия и анализ запаха

Были взяты образцы нетрансгенных растений и растений, принадлежащих к поколениям Т2.Три или четыре цветка на линию через 2–3 дня после цветения использовали, как описано ранее [47]. Мы собирали летучие, начиная с ZT3, в течение 6 часов в течение 24 часов. Все растения были акклиматизированы к 12 часам света / 12 часам темноты (12LD) и циклу 18/23 ºC. Уловленные летучие вещества анализировали с помощью газовой хроматографии и масс-спектрометрии (ГХ / МС), как описано в ссылке [8]. Цветочный аромат был проанализирован с помощью пакета R «gcProfileMakeR» (неопубликованные результаты), выбрав частоту 60% и качество по умолчанию. Количество выбранных летучих было выражено как интегрированная площадь, деленная на свежий вес цветка [48].Фаза рассчитывалась с использованием JTK-CYCLE, реализованного в «MetaCycle» [49] (R версия 3.5.1). Графики были построены с помощью «ggplot2» [50] с использованием удобной для дальтонизма палитры, предоставленной «viridis» [51]. Летучие пути были представлены с помощью программы «PathVisio» (версия 3.3.0) [52].

3. Результаты

3.1. Antirrhinum Majus LHY

Мы получили единственный каркас, который имел высокое сходство с геном LHY из Arabidopsis. Множественное выравнивание последовательностей транслированных белков показало высокий уровень гомологии LHY львиного зева (AmLHY) с другими генами, кодирующими LHY и REVEILLE (RVE) (рисунок S1, таблица S1).Всего мы идентифицировали семь RVEs, генов у львиного зева и один LHY с помощью BLAST, с высоким сходством с Arabidopsis (Таблица S2). Филогенетическая реконструкция с использованием предсказанных белков показала, что кластеры AmLHY с другими белками LHY, и они были четко отделены от клады RVE (Рисунок S1). Более того, CCA1a и CCA1b из Physcomitrella patens сгруппированы между кладами RVE1 / 2/7 и RVE4 / 8. LHY / CCA1 / RVE (AtLHY, AtCCA1 и AtRVE в Arabidopsis) представляют собой белки MYB, которые характеризуются консервативным ДНК-связывающим доменом [53,54,55]

Мы идентифицировали домен MYB и ДНК-связывающий домен HTH (мотив спираль-поворот-спираль) в AmLHY, которые были высококонсервативными по размеру и положению, как наблюдали у других видов, таких как Petunia или Vigna (Рисунок S1C).Кодирующая область AmLHY отличается от AtLHY. AmLHY показал дополнительные аминокислоты, которые привели к более длинному белку (рис. S2). Как упоминалось выше, мы идентифицировали семь генов, относящихся к семейству RVE у львиного зева, которые имели высокую гомологию с Arabidopsis, за исключением трех генов. Мы не смогли идентифицировать домен MYB в AmRVE1 / 2 / 7A и AmRVE1 / 2 / 7B, в то время как AmRVE1 / 2 / 7D показал два домена MYB (рисунок S1C), что свидетельствует о внутренней дупликации гена.

3.2. AmLHY демонстрирует суточный паттерн экспрессии

Мы проанализировали экспрессию AmLHY в листьях растений дикого типа в рамках цикла 12LD.Мы обнаружили, что экспрессия AmLHY увеличивалась в конце субъективной ночи, достигая пика ранним утром. AmLHY показал устойчивые и значительные колебания (a, p значение = 3,3 × 10 ^-06 ), как описано для других видов, включая Arabidopsis, вигну или дикий табак [54,56,57]. Мы выбрали растения T1 из трех независимых линий ( РНКи: AmLHY14 , РНКи: AmLHY26 и РНКи: AmLHY27 ). В T2 все выбранные строки отображали значительно более низкий уровень транскрипции AmLHY (b,). RNAi: AmLHY14 продемонстрировал в среднем 90% снижение уровней экспрессии AmLHY , RNAi: AmLHY26 на 65% и, наконец, RNAi: AmLHY27 на 74%.

Экспрессия AmLHY : ( a ) Суточная экспрессия в растениях дикого типа при цикле 12 часов света / 12 часов темноты (12LD); (b ) Экспрессия AmLHY на ZT1. 5 в линиях дикого типа (красный) и трансгенных линиях РНКи: AmLHY14 (зеленый), РНКи: AmLHY26 (синий) и РНКи: AmLHY27 (фиолетовый).Экспрессию определяли методом ΔΔCt с использованием дикого типа в качестве контроля. Контрольный ген был AmUBI . Каждая полоса представляет собой среднее значение ± стандартное отклонение от 3 до 4 биологических повторов.

Таблица 1

Экспрессия AmLHY в линиях дикого типа и РНКи при ZT 1.5. Экспрессия была нормализована по WT. Среднее и стандартное отклонение (SD) представляет от 3 до 4 биологических повторов. Процент нокдауна в линиях РНКи показан в столбце% KD. Различия проверяли с помощью t-критерия Стьюдента; a p -значение <0.05 указывает на значительное понижающее регулирование.

3.

Типичный цветок львиного зева имеет пять чашелистиков и пять лепестков, эти лепестки сливаются, образуя трубчатый и симметричный с двух сторон цветок. Мы не наблюдали изменений идентичности органов или аномального роста. Все растения имели полностью раскрытые цветки.

Мы охарактеризовали цветки львиного зева, анализируя 11 цветочных параметров, сравнивая линии Sippe 50 и RNAi: AmLHY дикого типа.Эти измерения включали чашелистики, лепестки и репродуктивные органы. Понижающая регуляция LHY не оказывала значительного влияния на размер цветка, за исключением высоты лепестка, расширения нижнего лепестка и нёба, которое уменьшилось в линии RNAi: AmLHY14 (Рисунок S3, Таблица S4).

3.4. AmLHY увеличивает скорость роста

Изучение мутантов, влияющих на размер цветков у Arabidopsis, Antirrhinum и других видов, в основном полагалось на анализ конечных точек мутантов [10,58]. Очень мало информации о кинетике роста, которая вызывает окончательные изменения в размерах. Изменения в росте, приводящие к различиям в окончательном размере, могут происходить в результате продолжительности периода роста, изменений скорости роста или комбинации обоих параметров. Мы использовали ранее описанную внутреннюю систему искусственного зрения для получения покадровых изображений линии RNAi: AmLHY27 и сестринского брата, разделяющего азиготы (Movie S1). Мы получили кривые роста для диких и трансгенных братьев и сестер, и результаты показали очень сильный эффект понижающей регуляции AmLHY на скорость роста цветков ().Максимальная скорость роста, достигаемая линией РНКи: AmLHY , составляла примерно 78% от нетрансгенного брата, а площадь под моделью кривой роста составляла 73% от нетрансгенного брата (). Максимальный наклон, использованный для расчета скорости роста [59], предполагает, что общая скорость роста составляет всего 51% по сравнению с диким типом. Насколько мы могли проанализировать, продолжительность периода роста цветков была сходной у WT и у RNAi: AmLHY27 , что указывает на то, что изменение циркадных часов растений влияет на скорость роста лепестков.

Кривая роста, выраженная в мм, цветков нетрансгенных (WT, фиолетовый) и РНКi.AmLHY27 (зеленый). Точки представляют необработанные данные, сплошные линии указывают скорректированную кривую, а пунктирные линии обозначают максимальный наклон, соответствующий максимальной скорости роста.

Таблица 2

Параметры получены из феномного анализа. Максимальный рост соответствует конечному максимуму кривой в мм. Максимальный наклон указывает на скорость роста. Площадь под моделью является оценкой разницы в накопленном росте.

Мы проанализировали цветочный аромат, испускаемый цветками дикого типа и цветками с РНКи : AmLHY , используя временной график с интервалом в шесть часов.Сбор летучих веществ проводили в рамках цикла 12LD. Мы обнаружили 15 соединений во время отбора проб (таблица S5). Большинство обнаруженных летучих веществ принадлежало к фенилпропаноидному / бензолоидному пути, но мы также обнаружили терпены, как описано ранее [60]. Мы разделили летучие органические соединения на две группы. Первая группа включала те ЛОС, которые способствовали формированию профиля запаха более 2% (основные летучие вещества), а вторая группа содержала оставшиеся соединения (второстепенные летучие вещества).

Основную группу составили пять соединений: ацетофенон, метилбензоат, 3,5-диметокситолуол, оцимен и линалоол.Мы обнаружили серьезные изменения в общем профиле (24 часа) у РНКи: AmLHY . Монотерпены оцимен и линалоол повышали их уровни в трансгенных линиях на 34,5% и 46,16% соответственно. Напротив, вклад летучих 3,5-диметокситолуола в профиль запаха был снижен на 23,6% у растений с РНКи. Ацетофенон и метилбензоат, два основных соединения, снизились, но незначительно в линиях РНКи (2,6 и 7,5% соответственно) (Рисунок S4). Эти пять соединений составили 98,35% профиля у растений дикого типа и в среднем 97.81% в RNAi: AmLHY линиях. Интересно, что второстепенные летучие компоненты, вклад которых в аромат аромата составлял 1,65% у WT и 2,19% у трансгенных линий, выявили наивысшую сложность аромата львиного зева. Мы классифицировали летучие вещества на две группы. В первую группу вошли соединения с пониженным профилем: альдегиды нонаналь и деканаль. Вторая группа включала бензоиды / фенилпропаноиды, 2-гидроксиацетофенон, бензальдегид, коричный спирт, этилбензоат, метилциннамат и метилсалицилат, а также терпены фарнезен и мирцен, которые увеличивали их вклад в запах (Рисунок S4).

Ежедневная эмиссия также выявила изменения в профиле запаха. В основных соединениях мы обнаружили, что вклад бензоидов ацетофенона и 3,5-диметокситолуола в профиль запаха был ниже в линиях РНКи во все проанализированные моменты времени. Уровень метилбензоата был ниже во всех временных точках, за исключением ZT15, где его вклад немного увеличился. Напротив, монотерпены линалоола и оцимена были выше в трансгенных линиях ().

Ежедневная эмиссия запахов основных соединений дикого типа ( a ) и трансгенных линий RNAi: AmLHY14 ( b ), RNAi: AmLHY26 ( c ), RNAi: AmLHY27 ( d ).Среднее значение линий РНКи представлено в ( и ). ZT указывает время zeitgeber .

Мы также наблюдали изменения в незначительных летучих компонентах. Вклад альдегидов в нонанальный и деканальный каналы был ниже у трансгенных линий. Кроме того, уровни бензадельгида, циннамилового спирта и метилсалицилата бензоид / фенилпропаноидов были выше в линиях RNAi: AmLHY . Остальные соединения, 2-гидроксиацетофенон, этилбензоат, метилциннамат и мирцен не показали устойчивой картины, как мирцен, который показал самый высокий прирост на 668% у ZT9, но снизился на 33% у ZT15 и на 37% у ZT21 ( ).

Ежедневная эмиссия запахов минорных соединений у диких типов ( a ) и трансгенных линий RNAi: AmLHY14 ( b ), RNAi: AmLHY26 ( c ), RNAi: AmLHY27 ( d ). Среднее значение линий РНКи представлено в ( и ). ZT указывает время zeitgeber .

В совокупности эти результаты предполагают сложную регуляцию синтеза и / или выброса летучих органических соединений с помощью AmLHY , действующего на разных уровнях по фенилпропаноидным / бензоидным и терпеновым путям.Все эти изменения привели к появлению другой и новой смеси запахов цветов.

3.6. AmLHY контролирует время испускания запаха

Мы обнаружили 15 летучих органических соединений (таблица S5; и). В цветках дикого типа большинство отобранных летучих веществ демонстрировали суточный характер. Выброс ЛОС начался рано утром, достигнув максимума в полдень или перед наступлением сумерек. Мы классифицировали выбрасываемые ЛОС на три группы в зависимости от времени их максимального выброса. В первую группу входят мирцен, оцимен, линалоол, деканаль, нонаналь, 3,5-диметокситолуол, 2-гидроксиацетофенон и метилциннамат, максимальная эмиссия которых наблюдается в начале дня и в полдень.Вторая группа включала коричный спирт и фарнезен, пик которых приходился на конец светового периода. Наконец, в третью группу вошли ацетофенон, метилбензоат и метилсалицилат, выбросы которых увеличивались в полночь (Таблица S6).

Напротив, мы обнаружили, что максимальная эмиссия некоторых ЛОС сдвинута в линиях РНКи, и мы разделили летучие вещества на три группы. Во-первых, монотерпен линалоол, альдегиды нонаналь и деканаль и бензоиды / фенилпропаноиды циннамиловый спирт, 3,5-диметокситолуол и 2-гидроксиацетофенон не имели каких-либо различий с цветками дикого типа, демонстрируя при этом максимальную эмиссию.Вторую группу составили производные метилбензоата и метилсалицилата бензойной кислоты, а также монотерпены мирцена и оцимена, которые задерживают их максимальное выделение. Наконец, ацетофенон, бензальдегид, метилциннамат (за исключением строки RNAi: AmLHY26 , которая не показала никаких различий) и сесквитерпен фарнезен рано достигли пика в трансгенных линиях (Таблица S6). Мы не смогли определить фазу этилбензоата из-за их нерегулярной эмиссии (Таблица S6).

На основе известного пути фенилпропаноид / бензоид мы разделили его на две основные ветви, которые имеют общий предшественник, L-фенилаланин.Первая ветвь включала те соединения, которые получены из транс-коричной кислоты, такие как метилциннамат. Вторая ветвь охватывает производные бензойной кислоты, метилсалицилат и метилбензоат (). Наши результаты показали, что понижающая регуляция AmLHY увеличивает максимальную эмиссию ацетофенона, бензальдегида и метилциннамата, в то время как вызывает задержку пика метилсалицилата и метилбензоата.

Схематическое изображение пути некоторых фенилпропаноидов / бензоидов ( a ), монотерпенов ( b ) и сесквитерпенов ( c ).Нелетучие соединения представлены пунктирным синим прямоугольником, а летучие соединения — сплошной линией и прямоугольником с закругленными углами, зеленый цвет указывает на летучее, которое отображает задержанное излучение, а красный цвет — расширенное излучение. Ферменты и IPP (изопентилдифосфат) C ₅ показаны над стрелками. Аббревиатуры ферментов: BA2H (2-гидроксилаза бензойной кислоты), BALDH (бензальдегиддегидрогеназа), BAMT (карбоксилметилтрансфераза бензойной кислоты), CCMT (карбоксилметилтрансфераза коричной кислоты), FS (фарнезенсинтаза), LS (линалоолсинтаза). мирценсинтаза), OCS (оцименсинтаза), PAL (фенилаланинаммиаклиаза) и SAMT (карбоксилметилтрансфераза салициловой кислоты).

Мы обнаружили аналогичную картину эмиссии терпенов. Геранилпирофосфат (GPP) является предшественником монотерпенов линалоола, мирцена и оцимена [61], реакции которых катализируются линалоолсинтазой (LS), мирценсинтазой (MYS) и оцименсинтазой (OCS) соответственно. Цветки РНКи показали замедленную эмиссию мирцена и оцимена с пиком в полдень (ZT6). Напротив, линалоол не пострадал. Эмиссия фарнезена, сесквитерпена, который образуется из фарнезилпирофосфата (FPP) путем добавления изопентилдифосфата (IPP) к GPP [62], была повышена у трансгенных львиный зев (Таблица S6).

В целом, наши результаты показывают, что AmLHY регулирует синтез и / или выброс летучих соединений на разных уровнях. Во-первых, основные изменения были обнаружены во вкладе второстепенных соединений, который составляет самую высокую долю разнообразия аромата львиного зева. Во-вторых, выброс этих ЛОС, полученных из транс-коричной кислоты (бензальдегид и метилциннамат), начался раньше, в то время как выбросы соединений, полученных из бензойной кислоты (метилбензоат и метилсалицилат), начались позже.Терпены мирцен и оцимен, которые разделяют предшественник GPP, также проявляют фенотип замедленной эмиссии, в то время как фарнезен достигает пика рано в линиях РНКи.

4. Обсуждение

В данной работе мы провели функциональный анализ гена Antirrhinum majus LHY . Ген LHY обнаружен как единственная копия гена во многих растениях, таких как петуния , арабидопсис, томат или Nicotiana attuata [23,57]. Наши результаты показывают, что в Antirrhinum есть единственный ген, который может иметь функции, аналогичные функциям, описанным у Arabidopsis, Petunia или Nicotiana , включая контроль роста и испускание запаха.В этой работе мы обнаружили функцию развития цветков, которая увеличивает скорость роста.

Мы обнаружили, что потеря функции LHY в Antirrhinum не влияет на идентичность органов. Несмотря на важность циркадных часов растений для поддержания фотосинтетического аппарата [63,64], наши результаты показывают, что циркадные часы растений не участвуют в деградации аппарата хлорофилла во время развития лепестков. Чепалоидные лепестки являются результатом снижения активности генов B-функции и их мишеней [65], но мы не смогли найти доказательств влияния AmLHY на идентичность лепестков.Транскрипционная структура циркадных часов растений варьируется между тканями, и возможные изменения часов растений в лепестках по сравнению с другими тканями или органами еще предстоит определить.

Размер боковых органов растений является результатом сочетания деления и размножения клеток. Множество мутантов, влияющих на эти процессы в Antirrhinum , показывают, что на рост лепестков могут по-разному влиять гены, указывающие на сложную координацию клеточного деления, размножения клеток и механизмов компенсации [66].Циркадные часы растений, как известно, контролируют рост клеток, наши результаты показывают, что AmLHY не влиял в равной степени на все проанализированные параметры цветков. Наши результаты не отличались от результатов для пасленовых, так как понижающая регуляция LHY не влияет на размер цветков, расстояние между лепестками и длину венчика у Nicotiana attuata или Petunia [27,28].

Временные рамки деления и размножения клеток играют ключевую роль в развитии растений.И продолжительность периода роста, и скорость роста определяют окончательный размер органа. Наш феномический анализ цветка Antirrhinum показывает, что период роста не контролируется AmLHY , тогда как скорость роста существенно снижается. Мы можем заключить, что период между клеточными делениями мог быть удлинен у растений RNAi, : AmLHY , что приводило к образованию органов с меньшим и / или меньшим количеством клеток. Эта гипотеза может потребовать дополнительной проверки. Недавние исследования показывают, что LHY подавляет синтез абсцизовой кислоты (ABA) и пути передачи сигналов [61], указывая на то, что недавно идентифицированный эффект AmLHY на рост может происходить посредством модуляции ABA.Наши результаты совпадают из-за медленной скорости роста, наблюдаемой у растений с РНКи, что подчеркивает роль циркадных часов в развитии цветов. Тот факт, что размер органов цветков существенно не уменьшается, но скорость роста замедляется в нокдаун-линиях AmLHY , указывает на то, что для достижения размера органа дикого типа может иметь место компенсация в терминах времени роста.

Цветочные ароматы играют ключевую роль во взаимодействии растений как с опылителями, так и с вредителями [14].Считается, что летучая смесь представляет собой сложную промежуточную фазу взаимодействия, специфичную для определенного вида [60]. Профиль запаха A. majus очень сложен, поскольку он включает фенилпропаноиды / бензоиды и терпены среди основных ЛОС. Предыдущие исследования показали, что подавление звука ZTL в Nicotiana atenuatta вызывает значительное снижение содержания бензилацетона, в то время как LHY вызывает раннюю эмиссию. Понижающее регулирование PhLHY вызывает более раннее выделение и уменьшение метилбензоата и бензилбензоата [27,28].Интересно, что шмели, один из опылителей A. majus , способны обнаруживать различия в ароматических смесях среди видов львиного зева, а дикий Antirrhinum , испускающий разные ароматические смеси, по-видимому, имеет специализированных опылителей [67,68]. Поскольку подавление звука AmLHY привело к новым соотношениям ароматов, это может изменить поведение опылителей. В будущих исследованиях может быть рассмотрен эффект подавления звука AmLHY и взаимодействие с опылителями, а также с вредителями и / или патогенами.

Мы обнаружили, что AmLHY играет сложную и центральную роль в координации испускания цветочного запаха, влияя на время и профиль запаха. Хотя он не оказывает большого влияния на общий выброс, он оказывает сильное влияние на выброс отдельных летучих веществ. Важное различие между Antirrhinum и Solanaceae Nicotiana и Petunia заключается в том, что он выделяет летучие вещества цветов преимущественно в течение дня. В отличие от ранее опубликованной работы в Petunia [27], мы обнаружили, что понижающая регуляция AmLHY вызывает замедленную эмиссию метилбензоата ().Мы можем заключить, что, поскольку паттерны экспрессии AmLHY и PhLHY идентичны, противоположный эффект на время испускания отдельных компонентов запаха, вероятно, координируется вторым слоем факторов транскрипции. Поскольку выделение отдельных летучих компонентов из фенилпропаноидов / бензоидов и монотерпенов / сесквитерпенов постоянно увеличивается или задерживается, оказывается, что может быть разница либо на уровне транскрипции, либо в фактическом метаболическом потоке, что приводит к наблюдаемым различиям.Эти два сценария не исключают друг друга, и будущие исследования должны помочь нам понять тонкую настройку испускания запаха AmLHY .

5. Выводы

Наша работа показывает, что AmLHY играет роль в росте и испускании запаха. Сочетание особенностей органов цветка и контроля циркадных ритмов является основными факторами, необходимыми для правильного развития цветка. Наши результаты также показали, что сложность цветочного аромата зависит от времени испускания, которое регулируется циркадными часами, и от вклада (или количества) каждого летучего вещества.Интересно, что подавление активности AmLHY влияет на пути биосинтеза летучих веществ в разных ветвях. Время выброса — дополнительная переменная, которую стоит проверить при взаимодействии растений и насекомых.

Дополнительные материалы

Следующие материалы доступны в Интернете по адресу https://www.mdpi.com/2073-4409/8/8/920/s1, Фильм S1: Рост цветков львиного зева, Рисунок S1: Филогенетическая реконструкция AmLHY, LHY и белки, предсказанные RVE, Рисунок S2: выравнивание белков AtLHY и AmLHY, Рисунок S3: Цветочные параметры у нетрансгенных (WT) и трансгенных линий ( РНКи: AmLHY ), Рисунок S4: 24-часовой профиль запаха, Рисунок S5: Всего летучие количества, Таблица S1: Номера доступа белков, используемых в филогенетической реконструкции, Таблица S2: Анализ BLAST, Таблица S3: Праймеры ПЦР, используемые в текущем исследовании, Таблица S4: Анализ параметров цветков в нетрансгенных и трансгенных линиях, Таблица S5: Время удерживания в минутах Таблица S6: Анализ ежедневных выбросов летучих веществ с помощью алгоритма JTK_CYCLE.

Вклад авторов

Концептуализация, M.I.T., F.P.-S., P.J.N., J.W. и M.E.-C .; курирование данных, M.I.T., F.P.-S., J.W. и M.E.-C .; формальный анализ, M.I.T., F.P.-S., P.J.N., J.W. и M.E.-C .; привлечение финансирования, P.J.N., J.W. и M.E.-C .; расследование, M.I.T., F.P.-S., P.J.N., J.W. и M.E.-C .; Методология, M.I.T., F.P.-S., P.J.N. и M.E.-C .; администрация проекта, P.J.N., J.W. и M.E.-C; ресурсы, J.W. и M.E.-C .; программное обеспечение, F.P.-S. и P.J.N .; наблюдение, П.J.N., J.W. и M.E.-C .; проверка, M.E.-C .; письмо — оригинальный черновик, M.I.T., J.W. и M.E.-C .; написание — просмотр и редактирование, M.I.T., F.P.-S., P.J.N., J.W., and M.E.-C.

Финансирование

Это исследование финансировалось Ministryio de Ciencia, Innovación y Universidades MICINN, гранты BFU-2017- 88300-C2–1-R (JW и MEC) и BFU-2017- 88300-C2-2-R (PJN) .

Конфликт интересов

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Список литературы

51. Гарнье С., Росс Н., Рудис Б., Скиайни М., Шерер С. viridis: Цветовые карты по умолчанию из «matplotlib» 2018.

AmLHY: (a) Ежедневная экспрессия в растениях дикого типа в течение 12 часов …

Контекст 1

… получен единственный каркас, который имел высокое сходство с LHY ген из Arabidopsis. Множественное выравнивание последовательностей транслированных белков показало высокий уровень гомологии LHY львиного зева (AmLHY) с другими генами, кодирующими LHY и REVEILLE (RVE) (рисунок S1, таблица S1). Всего мы идентифицировали семь генов RVEs у львиного зева и один LHY с помощью BLAST, с высоким сходством с Arabidopsis (Таблица S2)….

Контекст 2

… всего мы идентифицировали семь генов RVEs у львиного зева и один LHY с помощью BLAST, с высоким сходством с Arabidopsis (Таблица S2). Филогенетическая реконструкция с использованием предсказанных белков показала, что кластеры AmLHY с другими белками LHY, и они были четко отделены от клады RVE (Рисунок S1). Более того, CCA1a и CCA1b из Physcomitrella patens сгруппированы между кладами RVE1 / 2/7 и RVE4 / 8. …

Контекст 3

… CCA1a и CCA1b из Physcomitrella patens сгруппированы между кладами RVE1 / 2/7 и RVE4 / 8. LHY / CCA1 / RVE (AtLHY, AtCCA1 и AtRVE в Arabidopsis) представляют собой белки MYB, которые характеризуются консервативным ДНК-связывающим доменом [53] [54] [55] Мы идентифицировали домен MYB и ДНК-связывающий домен HTH. (мотив спираль-поворот-спираль) в AmLHY, которые были высококонсервативными по размеру и положению, как наблюдали у других видов, таких как Petunia или Vigna (Рисунок S1C). Кодирующая область AmLHY отличается от AtLHY….

Контекст 4

… упомянуто выше, мы идентифицировали семь генов, относящихся к семейству RVE у львиный зев, которые имеют высокую гомологию с Arabidopsis, за исключением трех генов. Мы не смогли идентифицировать домен MYB в AmRVE1 / 2 / 7A и AmRVE1 / 2 / 7B, в то время как AmRVE1 / 2 / 7D показал два домена MYB (рисунок S1C), что свидетельствует о внутренней дупликации гена. …

Контекст 5

… обнаружил, что экспрессия AmLHY увеличивалась в конце субъективной ночи, достигая пика ранним утром.AmLHY показал устойчивые и значительные колебания (рис. 1a, значение p = 3,3 × 10 -06), как описано для других видов, включая Arabidopsis, вигну или дикий табак [54,56,57]. Мы выбрали растения T1 из трех независимых линий (РНКи: AmLHY14, РНКи: AmLHY26 и РНКи: AmLHY27). …

Контекст 6

… отобрали растения Т1 из трех независимых линий (РНКи: AmLHY14, РНКи: AmLHY26 и РНКи: AmLHY27). В T2 все выбранные линии отображали значительно более низкий уровень транскрипции AmLHY (рисунок 1b, таблица 1).РНКи: AmLHY14 …

Контекст 7

… получили единственный каркас, который имел высокое сходство с геном LHY из Arabidopsis. Множественное выравнивание последовательностей транслированных белков показало высокий уровень гомологии LHY львиного зева (AmLHY) с другими генами, кодирующими LHY и REVEILLE (RVE) (рисунок S1, таблица S1). Всего мы идентифицировали семь генов RVEs у львиного зева и один LHY с помощью BLAST, с высоким сходством с Arabidopsis (Таблица S2). …

Контекст 8

… Всего мы идентифицировали семь генов RVEs у львиного зева и один ген LHY с помощью BLAST, с высоким сходством с Arabidopsis (Таблица S2). Филогенетическая реконструкция с использованием предсказанных белков показала, что кластеры AmLHY с другими белками LHY, и они были четко отделены от клады RVE (Рисунок S1). Более того, CCA1a и CCA1b из Physcomitrella patens сгруппированы между кладами RVE1 / 2/7 и RVE4 / 8. …

Контекст 9

… CCA1a и CCA1b из Physcomitrella patens сгруппированы между кладами RVE1 / 2/7 и RVE4 / 8.LHY / CCA1 / RVE (AtLHY, AtCCA1 и AtRVE в Arabidopsis) представляют собой белки MYB, которые характеризуются консервативным ДНК-связывающим доменом [53] [54] [55] Мы идентифицировали домен MYB и ДНК-связывающий домен HTH. (мотив спираль-поворот-спираль) в AmLHY, которые были высококонсервативными по размеру и положению, как наблюдали у других видов, таких как Petunia или Vigna (Рисунок S1C). Кодирующая область AmLHY отличается от AtLHY. …

Контекст 10

… упомянутых выше, мы идентифицировали семь генов, относящихся к семейству RVE у львиный зев, которые имеют высокую гомологию с Arabidopsis, за исключением трех генов.Мы не смогли идентифицировать домен MYB в AmRVE1 / 2 / 7A и AmRVE1 / 2 / 7B, в то время как AmRVE1 / 2 / 7D показал два домена MYB (рисунок S1C), что свидетельствует о внутренней дупликации гена. …

Контекст 11

… обнаружил, что экспрессия AmLHY увеличивалась в конце субъективной ночи, достигая пика ранним утром. AmLHY показал устойчивые и значительные колебания (рис. 1a, значение p = 3,3 × 10 -06), как описано для других видов, включая Arabidopsis, вигну или дикий табак [54,56,57].Мы выбрали растения T1 из трех независимых линий (РНКи: AmLHY14, РНКи: AmLHY26 и РНКи: AmLHY27). …

Контекст 12

… отобрали растения Т1 из трех независимых линий (РНКи: AmLHY14, РНКи: AmLHY26 и РНКи: AmLHY27). В T2 все выбранные линии отображали значительно более низкий уровень транскрипции AmLHY (рисунок 1b, таблица 1). RNAi: AmLHY14 …

Свежий львиный зев Antirrhinum Многолетние семена Желтые или красные 150 Семена и луковицы enoxmedia Однолетние и двухлетние семена

Свежие семена многолетних растений Snapdragon Antirrhinum, желтые или красные 150, семена многолетних растений Antirrhinum, желтые или красные 150 Свежий львиный зев, расстояние между растениями 12-18 дюймов, доступные цвета: рубиново-красный, желтый. , Морозостойкость до 10-35F, Низкие цены на складе. Аутентичные товары продаются в Интернете. Быстрая БЕСПЛАТНАЯ доставка. Последний стиль был в сети, хорошее качество.Семена желтые или красные 150 Свежий львиный зев Antirrhinum Многолетнее растение.

Unidad de Gentica

Автоматическая классификация конститутивных и неконституционных метаболитов с помощью gcProfileMakeR

Abstract

Анализ данных в нецелевой метаболомике занимает очень много времени.Генетические факторы и сигналы окружающей среды влияют на состав и количество имеющихся метаболитов, то есть на конститутивные и неконституционные метаболиты. Мы разработали gcProfileMakeR, пакет R, который использует стандартные файлы вывода из GC-MS для автоматического анализа данных с использованием номеров CAS. gcProfileMakeR производит три выхода: основной или конститутивный метаболом, второй список соединений с высококачественным соответствием, которое не является конститутивным, и третий набор соединений с низким качеством, совпадающим с библиотеками MS.В качестве доказательства концепции мы определили испускание цветочного запаха Antirrhinum majus с использованием растений дикого типа, мутантов цветочной идентичности с дефицитом и compacta , а также линий РНКи AmLHY . Утрата идентичности лепестков сопровождалась появлением альдегидов, характерных для летучих профилей зеленых листьев. Снижение уровней AmLHY вызвало значительное увеличение сложности летучих и активировало синтез бензилацетата, отсутствующего у WT. Кроме того, некоторые летучие вещества, выделяемые закрытым образом в WT, такие как метил-3,5-диметоксибезоат или линалоол, стали конститутивными.Используя шестнадцать летучих компонентов конститутивного профиля, все генотипы были классифицированы с помощью машинного обучения с ошибкой 0%. Таким образом, gcProfileMakeR может помочь определить основной и пан-метаболомы. Это повышает качество данных, представленных в метаболомных профилях, поскольку текстовые выходные данные зависят от номеров CAS. Это особенно важно для реализации ЧЕСТНЫХ данных.

Краткое изложение одним предложением gcProfileMakeR позволяет автоматически аннотировать основной метаболом и неконституционные метаболиты, увеличивая скорость и точность ненаправленной метаболомики.

Сноски

• Информация о финансировании: Эта работа была поддержана Министерством экономики и конкуренции [BFU2017-88300-C2-1R] до [MEC] [JW], [BFU2017-88300-C2-2R] до [ PJN]; Fundación Séneca [19398 / PI / 14] для [MEC] и грант на докторскую степень Министерства образования по культуре и депорте [FPU13 / 03606] для [VRH].

Границы | Влияние послеуборочных условий на Narcissus sp. Срезанные цветы ароматический профиль

Введение

Растения могут производить и выделять большое количество летучих органических соединений (ЛОС).Летучие вещества растений играют несколько сложных ролей в реакции на стресс и химическую коммуникацию, включая отпугивание вредителей, отпугивание травоядных, привлечение опылителей и взаимодействие растений и растений (Jürgens et al., 2000; Matsui, 2006; Niinemets et al., 2013; van Dam и Bouwmeester, 2016). Основные классы летучих соединений включают производные жирных кислот, терпеноиды и бензоиды / фенилпропаноиды, синтезируемые четырьмя основными путями: метилэритритолфосфат, мевалоновая кислота, липоксигеназа и шикимат / фенилаланин (Дударева и др., 2013; Muhlemann et al., 2014; Nagegowda, 2018).

Интересно, что растения выделяют смесь соединений, и их соответствующее количество определяет конкретную ароматическую смесь (Füssel et al., 2007; Weiss et al., 2016). Более того, профили запахов различаются между органами и тканями растений, такими как листья и лепестки, а также между видами, генотипами и даже продолжительностью жизни (Jürgens et al., 2002; Dötterl et al., 2005; Majetic et al., 2014). Кроме того, синтез и выброс летучих соединений зависят от биотических и абиотических факторов (Peñuelas and Llusià, 2001; Loreto and Schnitzler, 2010).Температура влияет на испускание цветочного запаха у различных видов, таких как Petunia, Osmanthus или Lilium (Sagae et al., 2008; Hu et al., 2013; Fu et al., 2017). Это указывает на то, что как условия выращивания, так и поддержание температуры во время послеуборочного периода могут повлиять на фактический профиль аромата. Интенсивность и качество света или спектральное распределение также играют роль в координации испускания запаха (Hu et al., 2013; Chuang et al., 2017). Количество высвобождаемых терпеноидов, спиртов или ароматических соединений увеличивается с увеличением интенсивности света у растений кукурузы и Lilium «Сибирь» (Gouinguené and Turlings, 2002; Hu et al., 2013). По сравнению с белым светом красный и дальний красный свет вызывают повышенное высвобождение фенилпропаноидов / бензеноидов в цветках петунии (Colquhoun et al., 2013).

Сенсорные качества фруктов и срезанных цветов, такие как аромат и вкус, очень важны для потребителей. И аромат, и вкус зависят от генотипа, управления урожаем, методов выращивания, зрелости, но также и послеуборочной обработки. Некоторые методы могут изменить и улучшить качество запаха и содержание сахаров и фенольных соединений.Обработка после сбора урожая включает контролируемую атмосферу (Lopez et al., 2000), УФ-B-облучение (Hagen et al., 2007) и температуру хранения, что широко изучалось в отношении фруктов и овощей. Например, плоды помидора и ананаса демонстрируют более высокое накопление ароматических соединений в виде сложных эфиров и кетонов при повышенных температурах (Maul et al., 2000; Liu and Liu, 2014). Более того, высокая температура не является оптимальной для перевозки на большие расстояния или длительного хранения, которые обычно требуют низких температур и осуществляются в темноте.Низкая температура предотвращает созревание плодов и распространение патогенов, но может привести к переохлаждению и потере вкуса и аромата (Imahori et al., 2008; Weiss and Egea-Cortines, 2009; Tietel et al., 2012).

Срезанные цветы также отправляются и хранятся в измененной атмосфере и / или при низких температурах. Как описано в отношении фруктов и овощей, устойчивость к низким температурам различается у разных видов (Redman et al., 2002). Низкая температура имеет нежелательные эффекты в виде симптомов переохлаждения, включая потерю окраски и уродство цветков (Joyce et al., 2000; Bunya-atichart et al., 2004). В дополнение к этому, неправильная обработка после сбора урожая может изменить ферментативную активность и вторичный метаболизм, влияя на состав летучих ароматических веществ.

Цветочные летучие вещества и их дистиллированные масла из Narcissus sp. важны в парфюмерной и химической промышленности (Remy, 2004). Цветение нарциссов, как и других геофитов, активизируется холодом и цветением зимой в средиземноморской среде (Rees and Wallis, 1970; Rees and Hanks, 1984; González et al., 1998). Правильные послеуборочные технические знания являются ключом к сохранению качества срезанных цветов. Подготовка к уборке урожая также влияет на выход и состав эфирных масел (Perry et al., 1999; Angioni et al., 2006). В последние годы несколько исследователей проанализировали взаимосвязь между окружающей средой и качеством и количеством летучих веществ. Терпены, многочисленная группа ЛОС, демонстрируют положительную корреляцию между испускаемым количеством, температурой и светом (Staudt and Lhoutellier, 2011; Chen et al., 2020). Еще один важный аспект — состав запаха, который изменяется в ответ на высокую температуру и засуху (Haberstroh et al., 2018). Что касается факторов окружающей среды, в нескольких исследованиях рассматривается изменение климата и его возможное влияние на летучие вещества растений (Yuan et al., 2009). Эффект потепления климата, казалось, различается по объемам выбросов, но оказывает заметное влияние на состав запаха (Faubert et al., 2012; Schollert et al., 2015). Изменения в смеси ароматов могут изменить некоторые биологические функции, такие как привлечение опылителей, защита растений или коммуникация между растениями (Farré-Armengol et al., 2013). Таким образом, условия окружающей среды, как до сбора урожая, так и после сбора урожая, играют решающую роль в синтезе и выбросе летучих веществ.

Хотя метаболомные исследования фруктов часто включают полные профили метаболитов, ряд исследований, описывающих воздействие окружающей среды на полные метаболомы цветов, проводился на очень небольшом количестве видов (Verdonk et al., 2003; Cheng et al., 2016). Целью данной работы было определение влияния условий окружающей среды в послеуборочный период на количество и состав Narcissus sp.(Amaryllidaceae) запах. Наши результаты указывают на значительное влияние световых режимов, и особенно температуры, на количество и профили запахов.

Материалы и методы

Заводские материалы и экспериментальный дизайн

Нарцисс (Amaryllidaceae) — группа многолетних луковичных, широко распространенных в бассейне Средиземного моря. Количество видов до сих пор неясно. Наличие нескольких гибридов затрудняет идентификацию видов нарциссов, а также определение их распространения (Santos-Gally et al., 2012; Marques et al., 2017). В Испании описано не менее 25 видов, а также различные гибриды (Aedo and Herrero, 2005). Мы использовали местный сорт сорта Narcissus под названием «махровый цветок», принадлежащий Cooperativa las Cabezuelas (рис. 1A). Первоначально сорт был выделен Матиасом Агила Ногуэра в 1960 году, основателем Las Cabezuelas, и с тех пор воспроизводится луковицами (DÁ, неопубликованное наблюдение). Растения росли как промежуточные культуры между органическими виноградными лозами в Лас-Кабесуэлас (Рисунки 1B, C), расположенном в Альхама-де-Мурсия (Испания), как описано ранее (Ruíz-Ramón et al., 2014). Нарциссы собирали при распускании цветов, совпадающих с распусканием цветков, а срезанные цветы доставляли в лабораторию, где стебли содержали в воде до отбора летучих проб. Поскольку цветки нарциссов имеют короткую продолжительность жизни, мы провели отбор летучих образцов в первые 24–36 часов после сбора урожая. Сбор урожая приходился на момент срезки в поле примерно в 8:30. Цветочные стебли держали на водяных стаканах и приносили в лабораторию в 18:00. Отбор проб проводился зимой 2015 и 2016 гг. Мы отобрали цветы без видимых повреждений.Перед взятием образцов каждый цветок взвешивали и помещали в камеру для выращивания. В исходных условиях цветы выдерживали в камере за 1 ч до внесения первого твистера. Мы собрали летучие вещества в шести различных условиях: четыре анализа были проведены в условиях свет: темнота и два — в постоянной темноте (см. Ниже). Постоянная темнота имитирует условия хранения и / или транспортировки. Зимой (декабрь-февраль) в Альхама-де-Мерсия средняя температура составляет 11,1 ± 5,2 ° C, минимум 4 и максимум 15.7 ° С. Мы решили изучить испускание аромата в диапазоне температур, аналогичных полевым (15-5 ° C), и смоделировать гипотетический теплый зимний день (20-10 ° C). Кроме того, мы также проанализировали влияние постоянной температуры, типичной для послеуборочных условий, на испускание запаха и профиль аромата. Затем были определены следующие экспериментальные условия для сравнения трех пар обработок: во-первых, мы проанализировали испускание запаха при 12-часовом цикле света и 12-часовом темноте (12LD) и двух различных температурных режимах: 20-10 ° C и 15-5. ° C.Самая высокая температура совпадала со световым периодом, а самая низкая температура соответствовала темной фазе. Мы определили группу 12LD и 15-5 ° C как контрольные условия. Второй эксперимент состоял в непрерывной темноте (12DD) и двух термопериодах: 20-10 ° C и 15-5 ° C. Наконец, в последнем эксперименте цветы были отобраны в цикле 12LD с постоянной температурой 20 ° C и 5 ° C соответственно. Для экспериментов свет: темнота мы определили zeitgeber time 0 (ZT0) как время включения света.Для экспериментов с постоянной темнотой мы определили ZT0 как время начала цикла высокой температуры.

Рисунок 1. Цветки Нарцисс sp. «Двойной цветок», использованный в исследовании. (A) Крупный план махрового цветка. (B) Растения в точке сбора урожая. (C) Обзор нарцисса, растущего как промежуточный урожай между органическими виноградными лозами.

Анализ летучих соединений

Для каждого эксперимента мы использовали пять срезанных цветов нарцисса.Один срезанный цветок в течение 24 ч помещали в стакан с 4% -ным раствором сахарозы, который помещали в эксикатор объемом 2 л. Каждый эксикатор состоял из стеклянной емкости, которую мы очищали до и после отбора проб 100% этанолом. Летучие вещества собирали с помощью сорбционной экстракции на магнитной мешалке SBSE, GERSTEL, покрытой полидиметилсилоксаном (PDMS) Twister, поскольку они оптимально поглощают летучие неполярные соединения (Bicchi et al., 2005). Твистеры предварительно кондиционировали, инкубируя при 40 ° C, постепенно повышая температуру до 300 ° C со скоростью 25 ° C / мин и выдерживая при 300 ° C в течение 20 минут.В каждый контейнер мы поместили скрепку, чтобы прикрепить стержень для перемешивания. В качестве отрицательного контроля мы использовали пустые эксикаторы (без срезанных цветов).

Мы проанализировали выброс летучих веществ в различные моменты времени в светлое и темное время суток или субъективно днем ​​и ночью. Две точки времени соответствовали субъективному дню и две — субъективной ночи, ZT0, ZT4, ZT16 и ZT22 для групп с постоянной темнотой и постоянной температурой и ZT4, ZT16, ZT22 и ZT24 для светлой; темной и циклической температуры.Твистеры оставляли в эксикаторах на 2 часа.

Летучие вещества были отделены и идентифицированы, как описано Manchado-Rojo et al. (2012). Вкратце, мы использовали газовый хроматограф 6890, соединенный с инертным масс-селективным детектором 5975 XL (Agilent Technologies) с блоком термодесорбции, охлаждаемой системой инжектора и универсальным пробоотборником (MPS2, GERSTEL). Мы использовали капиллярную колонку HP-5MS (длина 30 м, внутренний диаметр 0,25 мм, пленка 0,25 м) при постоянном давлении, используя гелий в качестве газа-носителя.Температуру повышали с 50 до 70 ° C (5 ° C в минуту), выдерживая 1 мин, а затем повышали до 240 ° C (10 ° C в минуту) и выдерживали 15 минут. Бруски Twister десорбировали, используя начальную температуру от 40 ° C до 150 ° C (100 ° C в минуту) и время выдержки 5 мин. Температура переноса составляла 300 ° C. Десорбированные соединения были криофокусированы на входе охлаждаемой системы инжектора при -100 C. Наконец, летучие вещества были перенесены в колонку путем нагревания входа CIS4 со скоростью 10 ° C сек ^–1 до 150 ° C с выдержкой. время 3 мин.

В тех случаях, когда у нас не было коммерческих стандартов для правильной идентификации ЛОС, мы предварительно идентифицировали соединения, используя Willey10th-NIST11b (Agilent Technologies, Wilmington, США). Интегрированная площадь пика каждого идентифицированного летучего вещества была нормализована путем деления ее на свежую массу цветка (Ruiz-Hernández et al., 2018).

Анализ данных

Мы сочли, что соединения, которые появляются в более чем 70% повторов, со средним качеством совпадения с библиотекой масс-спектров более 80%, могут рассматриваться как часть конститутивного испускания запаха цветков нарциссов при каждой обработке.Мы получили профили запахов с помощью библиотеки R «gcProfileMakeR» версии 2.2.2 (Pérez-Sanz et al., 2020). Мы установили параметры pFreqCutoff (минимальная частота среза, процент образцов, выделяющих летучие вещества) равным 0,70 и qcutoff (качество соединения, выраженное в процентах) равным 80. Мы также применили начальный фильтр для удаления соединений по их номеру CAS, например силоксаны, которые может происходить из стержней мешалки (Montero et al., 2005; дополнительная таблица 1). Чтобы визуализировать данные, мы классифицировали выбранные соединения в зависимости от их вклада в профиль запаха на две группы.Основные летучие компоненты вносили вклад в профиль запаха более 2%, а оставшиеся соединения составляли группу второстепенных летучих (см. Раздел «Результаты»).

Изучение биогенных летучих веществ может дать большой объем данных. Такие инструменты, как R-библиотека gcProfileMakeR, определяют профиль ядра и неконституционный профиль набора образцов (Pérez-Sanz et al., 2020). Эти профили можно анализировать с помощью методов машинного обучения. Они полезны для выявления изменчивых сигнатур, которые позволяют распознавать различные организмы (Ranganathan and Borges, 2010).Такие алгоритмы, как Random Forest (Breiman, 2001), могут идентифицировать соединения, которые можно использовать для классификации между различными наборами образцов.

Мы использовали алгоритм случайного леса для определения тех летучих веществ, которые можно использовать для классификации различных обработок фотопериода и термопериода (Breiman, 2001). Этот анализ был выполнен с помощью пакета R randomForest (Liaw and Wiener, 2002). Мы объединили все временные точки отбора проб для каждой реплики, фотопериода и термопериода.

Чтобы проанализировать влияние экспериментальных условий и моментов времени отбора проб на количество запахов, мы выполнили тест Крускалла-Уоллиса с последующим тестом Данна в качестве апостериорного анализа , реализованного в пакетах stats и dunn.test (R версия 3.6.1) (Динно, 2017).

Мы использовали анализ главных компонентов (PCA), чтобы изучить различия между экспериментальными методами лечения. Полный набор летучих для каждой точки реплики был использован в качестве входных данных. Анализ был выполнен в R с использованием функции prcomp пакета stats и нанесен на график с помощью ggfortify (Tang et al., 2016).

Результаты

Профили запахов подвержены влиянию фотопериода и термопериода

Срезанные цветы нарцисса имели сложный профиль. Количество соединений, идентифицированных с помощью ГХ-МС, варьировалось в зависимости от условий и дня. Всего мы идентифицировали 73 соединения с качеством выше 80% (дополнительный рисунок 1 и таблица 1). Для каждой экспериментальной группы мы отфильтровали список летучих веществ с помощью библиотеки R «gcProfileMakeR» (Pérez-Sanz et al., 2020). Мы выбрали летучие вещества, выделяемые более чем из 70% образцов, с минимальным качеством 80% для каждого экспериментального условия, обозначив их как составные летучие вещества.Мы получили список из 68 летучих веществ, присутствующих в шести различных экспериментальных условиях. Они были разделены на составляющие, где мы обнаружили 14 летучих органических соединений, и неконституционные, состоящие из 64 летучих органических соединений (рисунок 2 и дополнительный рисунок 1). Минимальное качество мирцена составило 87%. Эти соединения состояли в основном из монотерпенов и фенилпропаноидов (таблица 1). Остальные обнаруженные летучие вещества не являлись составными и были обнаружены менее чем в 70% проб для данных условий окружающей среды (дополнительный рисунок 1).Мы определили группу срезанных цветов, отобранную при 12-часовом освещении: 12-часовую темноту (12LD) и 15-5 ° C в качестве контрольной группы. Это типичные дневные / ночные температуры, наблюдаемые в поле в декабре / январе, когда они цветут (Viti et al., 2010).

Таблица 1. Отдельные летучие органические соединения из срезанных цветов нарцисса.

Рис. 2. Тепловая карта летучих веществ, выделяемых Нарциссом в экспериментальных условиях. Первый столбец показывает номер химического абстрактного сервиса (CAS) летучих веществ.12LD обозначает 12-часовой цикл свет: темнота и 12DD постоянную темноту. Черный цвет указывает на обнаруженное соединение, а белый — на необнаруженное соединение.

Мы обнаружили 13 различных соединений при температуре 12LD и температуре 15-5 ° C (рис. 2). Когда мы сымитировали ситуацию теплой зимы с 12LD и 20-10 ° C, мы обнаружили индол, которого не было в контрольных условиях, в то время как циннамилацетат стал несущественным компонентом профиля (рисунок 2 и дополнительный рисунок 1). . Растения в постоянной темноте (12DD) с термоциклом выделяли 10 ЛОС при 20-10 ° C и 8 летучих при 15-5 ° C.Напротив, цветы при 12LD и постоянной температуре показали меньшую сложность. Мы обнаружили только 8 и 6 летучих веществ при 20 и 5 ° C соответственно. Мы обнаружили наивысшую сложность, определяемую как количество обнаруженных ЛОС, при циклическом освещении и термопериодических условиях.

Поскольку количество обнаруженных соединений варьировалось в зависимости от условий эксперимента, мы выделили четыре группы. В первую группу вошли четыре устойчиво испускаемых соединения, которые были обнаружены независимо от условий освещения или температуры.Это были монотерпены эвкалиптол, линалоол и оцимен, а также бензоид бензилацетат. Таким образом, эти соединения можно рассматривать как общий профиль химического запаха этого сорта Narcissus . Вторая группа содержала 3,4-диметил-2,4,6 октатриен, пинен и бензолпропанол, которые были обнаружены только в условиях смены света и температуры. Монотерпены мирцен и лимонен не были обнаружены при постоянной температуре 5 ° C или 20 ° C (рис. 2). Остальные соединения, индол, фенэтилацетат и пренилацетат, варьировали.Хотя многие соединения появлялись в разных условиях, их количество или вклад варьировались (рис. 2, см. Ниже). Мы можем сделать вывод, что профиль аромата Нарцисса включает набор летучих веществ, устойчиво продуцируемых в различных условиях окружающей среды, второй набор, который требует условий светового цикла, третий набор, который зависит от термопериода, и последний набор с переменным поведением.

Мы исследовали различия в качественных изменениях за периоды выборки, чтобы определить возможные кластеры.Мы использовали PCA в разные моменты времени и сравнили три пары процедур (рис. 3). Два первых основных компонента, PC1 и PC2, объяснили 68,57% вариации (ZT0), 60,51% (ZT4), 57,98% (ZT16), 74,29% (ZT22) и 84,05% (ZT24) (рис. Таблица 2). Группы, отобранные при температурах 12LD / 15-5 ° C, 12DD / 15-5 ° C и 12LD / 5 ° C, показали аналогичную картину и сгруппировались вместе. Напротив, ароматическая смесь нарциссов, отобранная при температуре 12LD и постоянной 20 ° C, отличалась от других групп нарциссов.Мы также наблюдали изменения во времени и условиях. При ZT0 образцы 12DD / 15-5 ° C и 12LD / 5 ° C были похожи и сгруппированы вместе, тогда как 12DD / 20-10 ° C и 12LD / 20 ° C различались. В ZT4 нарциссы при 12LD / 15-5 ° C и 12LD / 20-10 ° C, постоянной темноте и постоянной температуре показали аналогичное распределение. Обработка при постоянной температуре 5 ° C позволила получить чрезвычайно компактный кластер. Он был сосредоточен на большинстве профилей, так как он включает четыре основных летучих компонента, обнаруживаемых при любых условиях. Как упоминалось ранее, на ZT16 и ZT22 все экспериментальные условия показали аналогичную картину, за исключением тех нарциссов, образцы которых были взяты при 12LD и 20 ° C.Наконец, при ZT0 образцы аромата 12LD / 15-5 ° C и 12LD / 20-10 ° C были разными (рис. 3).

Рис. 3. Анализ главных компонентов (PCA) на основе летучих веществ, испускаемых нарциссами, в пяти временных точках (ZT, zeitgeber time) в шести различных условиях освещения: темноты и температуры. LD, светлый: темный; DD, постоянная темнота; ПК, главная составляющая.

Мы обнаружили, что важность каждого летучего вещества (выраженного как факторы нагрузки) для аромата нарцисса менялась в течение дня (дополнительная таблица 2).

Первый главный компонент показал, что наиболее важными летучими веществами были оцимен в ZT0, ZT4, бензилацетат в ZT16 и ZT22 и пинен в ZT24. Летучие лимонен в ZT0 и ZT4, оцимен в ZT16 и ZT24 и фенэтилацетат в ZT22 положительно влияли на PC2 (дополнительная таблица 2). Два из этих летучих веществ, бензилацетат и оцимен, выделялись постоянно. Напротив, пинен отсутствовал в нарциссах, отобранных в постоянной темноте и постоянной температуре, фенэтилацетат не обнаруживался при постоянных 5 ° C, а эмиссия пинена была переменной и обнаруживалась при 12LD / 15-5 ° C, 12LD / 20-10 ° C, и 12DD / 20-10 ° C (рисунок 2).Все эти результаты свидетельствуют о том, что температура, свет и дневное время определяют ароматную смесь срезанных цветов нарцисса, а также характер ее излучения.

Влияние термопериода и фотопериода на количественные изменения в профилях запаха

Вклад каждой летучей в цветочный аромат определяет конкретную ароматическую смесь. Предыдущее исследование охарактеризовало цветочный аромат нескольких видов нарциссов (Dobson et al., 1997). В ароматическом профиле, полученном в настоящей работе, преобладали монотерпены и фенилпропаноиды.Однако также были обнаружены амины и бензоид (рисунок 2 и дополнительный рисунок 1; Ruíz-Ramón et al., 2014). Мы разделили нарциссы на три экспериментальные группы, и каждая группа состояла из двух разных световых: темных и температурных условий, взяв образцы летучих веществ в четырех временных точках. Поскольку мы ожидали увидеть изменения с течением времени, а также среди экспериментальных обработок, мы выполнили два разных анализа. Во-первых, мы проанализировали каждую группу и каждую пару, чтобы определить, увеличился или уменьшился выброс летучих в разное время дня / ночи (Рисунки 4A – F и Таблица 2).Эти данные были преобразованы в журнал.

Рис. 4. Общее ароматическое излучение цветка нарцисси при шести различных световых условиях: темноте и температуре. Летучие вещества отбирали в четырех временных точках (ZT). Чтобы обнаружить паттерны испускания запаха, мы проанализировали каждую группу по времени (A – F) . Мы также сравнили испускаемое количество в шести экспериментальных условиях в каждый момент времени (G) . Каждая полоса представляет собой среднее значение ± стандартное отклонение пяти цветов. Буквы над полосами указывают на различия между временными точками (A – F) и группами (G) (тест Данна, см. Таблицы 2, 3), LD, светлый: темный; DD, сплошной темный; fw, свежий вес.

Таблица 2. Анализ испускания летучих нарциссов в четырех временных точках при различных световых и температурных условиях.

Анализ временных рядов выявил различные модели испускания запаха (Рисунки 4A – F и Таблица 2). В контрольных условиях, 12LD и 15-5 ° C, максимальное выделение запаха происходило в течение светового периода на ZT4 и значительно снижалось ночью (тест Данна p <0,05, фигура 4A). Напротив, при 12LD и 20-10 ° C испускание запаха прогрессивно и значительно увеличивалось в течение светлого-темного периода, показывая обратное (Рисунок 4B).В постоянной темноте и независимо от температурных режимов, эмиссия имела замедленный характер по сравнению с контролем (Рисунки 4C, D). Действительно, контрольная максимальная эмиссия имела место при ZT4, в то время как постоянная темнота достигала максимума при ZT16 и после этого значительно снижалась (тест Данна p <0,05, таблица 2 и фигуры 4C, D). Эмиссия цветков нарциссов, отобранная при постоянной температуре 5 ° C, уменьшалась в полночь (ZT16), тогда как при постоянной 20 ° C испускалась довольно стабильная (Рисунки 4E, F).

Чтобы оценить влияние света и температуры на общее испускание запаха, мы сравнили испускаемое количество в каждый момент времени (рисунок 4G и таблица 3).Мы проанализировали каждую пару экспериментальных условий, например, постоянные 5 и 20 ° C, и сравнили все группы среди них. В ZT0 мы не наблюдали различий между парами нарциссов ( p > 0,05). Кроме того, количество испускаемых веществ в постоянной темноте и постоянной температуре различается, и мы наблюдали самый низкий уровень выбросов при постоянных 5 ° C (Рисунок 4G и Таблица 3). На ZT4 испускаемое количество различается между двумя экспериментальными парами: 12LD / 15-5 ° C и 12LD / 20-10 ° C и постоянные 5 и 20 ° C ( p <0.05). Сравнивая все группы, мы заметили, что цветы ниже 12LD / 20-10 ° C и 12LD / 5 ° C показали наименьшее излучение (Рисунок 4G). Мы наблюдали похожую картину на ZT16. Две группы нарциссов, отобранные при постоянной температуре, показали значительную разницу в количествах выбросов ( p <0,05), тогда как остальные пары не изменились. Когда мы сравнили все группы, мы обнаружили, что самые низкие выбросы соответствовали 12LD / 20-10 ° C и 12LD / 5 ° C, как это наблюдалось на ZT4 (рисунок 4G и таблица 3). На ZT22 мы наблюдали разницу только в паре 12LD / 15-5 ° C и 12LD / 20-10 ° C ( p <0.05, рисунок 4). Кроме того, выбросы при 12LD / 20-10 ° C и 12LD / 20 ° C были выше по сравнению с другими группами (Рисунок 4G и Таблица 3). Наконец, на ZT24 пара, отобранная при температуре LD и цикла, показала значительную разницу между 15-5 ° C и 20-10 ° C, с самым высоким уровнем выбросов при 20-10 ° C (рисунок 4G и таблица 3).

Таблица 3. Анализ испускания летучих нарциссов при различных световых и температурных условиях.

Несмотря на то, что характер излучения менялся от группы к группе (Рисунки 4A – F, см. Выше), образцы нарциссов, отобранные при постоянной температуре, показали важные различия, за исключением ZT0.Эмиссия запаха нарцисса при постоянной 20 ° C была выше, чем при 5 ° C (рисунок 4G и таблица 3).

Можно сделать вывод, что на испускание цветочного аромата сильно влияют температурные режимы у Narcissus , тогда как свет играет меньшую роль.

Влияние термопериода и фотопериода на качественные изменения в профилях запаха

Наблюдаемые изменения в испускании запаха среди групп нарциссов (Рисунок 4G и Таблица 3) могут быть результатом различных моделей испускания (Рисунки 4A – F и Таблица 2), влияния температуры на ферментативную активность, хранение и / или высвобождение ЛОС, но также может быть связано с отсутствием некоторых летучих веществ (Рисунок 1).Мы исследовали испускание каждого летучего вещества и его вклад в запах нарцисса (рис. 5).

Рисунок 5. Суточная эмиссия летучих нарциссов. Каждая полоса представляет собой среднюю эмиссию ± стандартное отклонение пяти цветков в четыре различных момента времени ( zeitgeber time, ZT).

При циклическом освещении и обоих температурных циклах, 15-5 ° C и 20-10 ° C, мы обнаружили первую группу летучих веществ с максимальными выбросами в световой период. К ним относятся 3,4-диметил-2,4,6-октатриен, эвкалиптол и лимонен.Напротив, вторая группа достигла максимального количества ночью. Он включал бензолпропилацетат, бензолпропанол, мирцен и пренилацетат. Другие соединения, такие как оцимен, не следовали четкой схеме. При цикле 15–5 ° C наибольшая эмиссия оцимена происходила в течение светового периода, тогда как при температуре ниже 20–10 ° C это летучее вещество проявляло максимальное количество ночью (рис. 5).

Образцы цветов, отобранные в постоянной темноте с изменяющейся температурой 15-5 ° C и 20-10 ° C, показали две модели.Наибольшее количество индола, бензилацетата, бензолпропилацетата, линалоола и фенэтилацетата было обнаружено при ZT4. Напротив, мы обнаружили наибольшее количество эвкалиптола, лимонена, мирцена, оцимена, циннамилацетата и пренилацетата в течение субъективной ночи при ZT16 и ZT22 (рис. 5).

Как упоминалось выше, мы обнаружили наибольшее количество летучих веществ при цикле свет: темнота и постоянной температуре 20 ° C (рис. 4). Интересно, что максимальное количество всех летучих веществ появляется в темный период, в ZT16 или ZT22.Эта картина была аналогичной при цикле свет: темнота с постоянной температурой 5 ° C. Действительно, выделяемое количество эвкалиптола, линалоола, оцимена и пренилацетата увеличивалось в темный период (рис. 5). Напротив, бензилацетат и фенэтилацетат показали максимальное излучение в течение светового периода. В целом эти результаты показали, что максимальные уровни летучих веществ зависели от времени суток, освещения и температурных условий. Кроме того, образцы нарциссов, отобранные при постоянных 5 ° и 20 ° C, показали меньшее количество летучих по сравнению с контрольной группой (рис. 2).В данном случае казалось, что температура, а не количество выделяемых соединений определяют интенсивность запаха (рисунки 4, 5).

Классификация случайных лесов

Полученные профили запахов сильно различались при разных температурных и световых режимах. Мы исследовали, можно ли с помощью алгоритмов машинного обучения классифицировать расходящиеся профили как разные. Чтобы идентифицировать летучие среди 14 выбранных соединений, которые могут быть полезны для классификации, мы использовали алгоритм случайного леса.Модель правильно классифицировала все образцы, за исключением одного с непрерывной температурой LD 20 ° C, который был классифицирован как непрерывный 5 ° C (Таблица 4). Полученная ошибка выдачи (OOB) составила 3,33%. Этот анализ ранжировал летучие вещества на основе среднего убывающего значения точности (MDA) (Таблица 5). Пятью наиболее важными летучими веществами, которые следует классифицировать между светом, темнотой и температурой, были индол, лимонен, циннамилацетат, мирцен и бензолпропилацетат (таблица 5). Эти результаты подтвердили, что профиль запаха отличался в зависимости от анализируемых условий.Однако, как уже упоминалось выше, постоянные температуры, типичные для послеуборочных условий, вызвали самые резкие изменения в профилях запахов.

Таблица 4. Матрица беспорядка случайного леса, показывающая наблюдаемые и прогнозируемые группы среди световых: темных и температурных циклов.

Таблица 5. Рейтинг важности летучих органических соединений (ЛОС) для классификации нарциссов с помощью алгоритма случайного леса, основанного на средней убывающей точности (MDA).

Обсуждение

Абсолютные выбросы и специфический состав ароматизаторов являются двумя факторами, как для промышленности, так и на экологическом уровне. Действительно, промышленное качество эфирных масел основано на конкретном составе как в качественном, так и в количественном отношении (Nejad Ebrahimi et al., 2008; Nabiha et al., 2009). Ароматическая композиция является важным компонентом разведения декоративных растений, таких как Chrysanthemum или Iris (Sun et al., 2015; Yuan et al., 2019). Поскольку окружающие условия могут влиять на испускание запаха на метаболическом уровне и / или накопление и испарение аромата (Hu et al., 2013; Farré-Armengol et al., 2014; Cna’ani et al., 2015), мы изучили эффект света и температуры на аромате Narcissus .

Излучение запаха также связано с развитием цветка и быстро прекращается при старении цветков (Дударева и др., 2000; Weiss et al., 2016). Поскольку сорт Narcissus , использованный в этом исследовании, показал очень короткую жизнь, нам пришлось провести однодневные тесты.Сложность аромата цветка омелы уменьшается с течением времени его жизни, летучие вещества, такие как нонанал и фарнезен, присутствовали не на всех стадиях цветения. В то же время количество выделяемого оцимена увеличивается в течение жизни цветков (Quintana-Rodríguez et al., 2018). Эти модификации аромата происходят в течение нескольких дней, предполагая изменения в биосинтезе, накоплении и высвобождении летучих, и могут быть учтены при обработке после сбора урожая. Эксперименты на львином зеве и диких родственниках показали стабильный ароматический профиль в течение 3-5 дней, что указывает на наличие генетического компонента, определяющего продолжительность жизни цветков (Weiss et al., 2016). Это также может играть важную роль в испускании и стабильности запаха.

Некоторые цветущие виды, включая розы, львиный зев или табак, демонстрируют устойчивый циркадный ритм (Колосова и др., 2001; Рагусо и др., 2003; Пиконе и др., 2004). Устойчивые колебания циркадного запаха поддерживаются PhLHY, NaZTL, PhCHL, AmLHY и PhGI1 (Fenske et al., 2015; Yon et al., 2015; Terry et al., 2019a, b; Brandoli et al. , 2020). Поскольку координацию циркадного испускания запаха можно рассматривать как нисходящий процесс часов, важно определить, реагируют ли ежедневные изменения в испускании запаха на резкие изменения условий окружающей среды, такие как те, которые используются после сбора урожая, или на естественные изменения при растущих температурах.

Ежедневные изменения в структуре выбросов и количества летучих веществ вызывают изменение цветочного аромата в течение дня (Barman and Mitra, 2019; Terry et al., 2019a, b). Ароматическая смесь играет роль в привлечении опылителей, защите растений и взаимодействии растений с растениями, среди прочего (Heil and Ton, 2008; Schiestl, 2010; Ueda et al., 2012), и изменения аромата могут изменить эти функции. Как сообщалось ранее, аромат нарциссов состоял из монотерпенов, но также из бензоидов и фенилпропаноидов (Dobson et al., 1997; Руиз-Рамон и др., 2014). Наши результаты показали, что изменение условий света: темноты и температуры может кардинально изменить ароматную смесь. Мы идентифицировали 14 летучих органических соединений, четыре из которых, бензилацетат, эвкалиптол, линалоол и оцимен, выделялись постоянно. Срезанные цветы нарцисса также выделяют летучие фенилпропаноиды и бензоиды. Мы можем сделать вывод, что производство как бензоидов, так и монотерпенов устойчиво к изменениям условий окружающей среды, однако не все монотерпены были продуцированы надежно.Действительно, выбросы 3,4-диметил-2,4,6-октатриена, пинена, мирцена и лимонена контролировались светом или температурой. Как наблюдалось в монотерпеновых соединениях, бензилацетат был конститутивным, в то время как все фенилпропаноиды менялись в зависимости от условий окружающей среды. Поскольку пути синтеза монотерпенов являются общими (Dudareva et al., 2003; Byers et al., 2014), а бензоиды и фенилпропаноиды синтезируются из фенилаланина (Boatright et al., 2004), возникает новая гипотеза, что транспорт и / или синтез может быть затронут на определенных этапах биосинтеза.Влияние температуры на испускание запаха у Narcissus , по-видимому, является обычной реакцией у других геофитов.

Подобно терпенам, хранящимся в листьях, цветы могут накапливать несколько летучих соединений, таких как петуния, которая накапливает гликозилированные фенилпропаноиды, которые метаболизируются во время выброса (Cna’ani et al., 2017). Метаболизм фенилпропаноидов, а также его возможное накопление в цветках нарциссов могут объяснить различия в уровнях испускания при различных условиях освещения и температуры.Наши результаты согласуются с результатами, полученными для петунии, за исключением постоянной температуры 20 ° C. Поскольку терпеноиды и фенилпропаноиды демонстрируют расходящиеся паттерны, мы заключаем, что их синтез или испускание могут иметь различную генетическую координацию.

Групповое сравнение температурной и световой обработки показало, что обнаруженные основные различия связаны с постоянными температурами. Действительно, максимумы выбросов менялись от дня к ночи при сравнении 15-5 до 20-10 ° C, что указывает на сильное влияние дневных и ночных температур на общее выделение запахов.Тот факт, что непрерывная темнота не влияет на максимальные выбросы, а постоянные температуры вызывают несколько пологую кривую, указывает на то, что общая температура имеет наибольшее влияние на Narcissus . Было показано, что изменения температуры влияют на количество выделяемых соединений в таких растениях, как Quercus ilex , Sonchus tenerrimus и Lilium sp. (Hu et al., 2013; Farré-Armengol et al., 2014). Эта картина была особенно заметна при постоянной температуре 20 ° C, тогда как наименьшее количество выделяемых ЛОС было обнаружено при постоянной температуре 5 ° C (Рисунок 4).Время максимальной эмиссии при 12LD и 15-5 ° C приходилось на световую фазу, но было отложено до полуночи при 20-10 ° C. Постоянная темнота смещала максимальное излучение к концу темного периода, а при постоянной температуре испускание запаха нарцисса, как правило, достигалось в темную фазу. Эти изменения предполагают, что послеуборочные условия определяют характер эмиссии, указывая на то, что свет и температура также контролируют накопление летучих и, возможно, других вторичных метаболитов. Поскольку промышленные послеуборочные условия обычно имеют фиксированные режимы света и температуры, этот аспект можно решить, чтобы улучшить экстракцию эфирного масла.

Поскольку предуборочные условия важны для аромата цветов, качества и количества эфирных масел (Angioni et al., 2006; Chen et al., 2020), рост в условиях теплого климата может изменить эти свойства. Некоторые исследования предполагают, что температура положительно связана с испусканием летучих веществ (Faubert et al., 2010), включая изменение профиля запаха (Faubert et al., 2012). Однако некоторые виды, по-видимому, имеют стабильные выбросы в изменяющейся среде, например, арктические кустарники Empetrum hermaphroditum и Cassiope tetragona (Schollert et al., 2015). Температура может регулироваться на разных уровнях, включая метаболизм, доступность субстратов, активность ферментов и / или механизмы накопления и высвобождения (Oyama-Okubo et al., 2005; Farré-Armengol et al., 2013; Barman and Mitra, 2019). Это также может зависеть от видов, тканей и органов (Schollert et al., 2015; Jamieson et al., 2017).

Из-за сложности летучести растений методы классификации, такие как анализ главных компонентов или алгоритмы машинного обучения, как случайный лес, полезны для выявления закономерностей и уменьшения количества соединений, которые можно использовать для различения связанных видов или разновидностей, среди других процедур. (Ранганатан и Борхес, 2010; Дос-Сантос и др., 2013; Брюкнер и Хитхофф, 2017). В этом исследовании нарциссы в контрольных условиях выявили более 50 различных идентифицированных соединений с качеством выше 80% (дополнительный рисунок 1). Мы использовали пакет R «gcProfileMakeR», чтобы уменьшить количество соединений (Pérez-Sanz et al., 2020), в зависимости от их частоты, и мы применили алгоритм классификации случайного леса. Случайный лес показал очень низкий уровень ошибок. Только один образец был неправильно классифицирован, что свидетельствует о том, что различия в цветочном аромате между обработками были значительными с математической точки зрения.

Четыре ЛОС, обнаруженные с более высоким уровнем МДА, — это индол, D-лимонен, циннамилацетат и β-мирцен. Эти соединения выделялись по-разному, поскольку индол был обнаружен только в четырех из шести условий, циннамилацетат был обнаружен при 20-10 ° C или 20 ° C, в то время как β-мирцен исчезал при постоянных температурах. Это указывает на возможность обогащения или уменьшения отдельного компонента ароматического профиля путем изменения условий роста и / или хранения.

Наше исследование показало, что температурные режимы изменили испускание запаха на нескольких уровнях, включая ритмическое испускание, количество испускаемого вещества и состав аромата.В целом эти модификации привели к созданию новых смесей ароматов, которые могут быть полезны в декоративной и парфюмерной промышленности. В будущих перспективах следует рассмотреть возможность анализа внутреннего пула летучих веществ, а также активности задействованных ферментов и механизмов испарения.

Представленные данные показывают, что послеуборочные условия влияют на состав и количество аромата, излучаемого цветами нарцисса. Кроме того, в течение дня меняется и состав цветочных букетов. Эти результаты могут быть интересны для парфюмерной и декоративной промышленности.Наши результаты показывают, что поддержание как термопериода, так и фотопериода более целесообразно для сохранения высококачественного профиля аромата. Примечательно, что температура 15-5 ° C с фотопериодом 12:12 LD, напоминающая естественные зимние условия выращивания, может считаться лучшей экологической обработкой для послеуборочных цветков нарцисса с точки зрения профиля аромата.